افتراق سرووارهای بیماریزا از غیربیماریزای لپتوسپیرا به روش PCR بر مبنای ژن ompLI و طراحی یک کنترل مثبت جهت بهینه سازی این تست تشخیصی

زمینه و اهداف: لپتوسپیروزیس، شایع ترین بیماری مشترک بین انسان و حیوان در سراسر جهان است. تشخیص صحیح و به موقع این بیماری حائز اهمیت می باشند. به علت کند رشد بودن لپتوسپیرا و شرایط خاص نگه داری و عدم دسترسی همگان به سوش های رفرانس استفاده از یک تست سریع و دقیق مولکولی مانند PCR به همراه یک کنترل مثبت به منظور تایید صحت آن ضروری می باشد. ژن ompLI فقط در لپتوسپیراهای پاتوژن وجود دارد و در میان آنها شدیدا حفظ شده است. بنابراین می توان از آن در تست های تشخیصی مولکولی مانند PCR استفاده کرد. در تست PCR جهت اطمینان از دست یابی به نتیجه صحیح نیازممند یک کنترل مثبت هستیم. هدف این تحقیق بهره گیری از خصوصیات ژن ompLI به منظور افتراق سرووارهای بیماریزای لپتوسیپیرا از غیر بیماریزا با استفاده از PCR و طراحی یک کنترل مثبت جهت بینه سازی این تست می باشد. روش بررسی: در این تحقیق از پنج سرووار بیماری زای لپتوسپیرا و یک سرووار غیر بیماری زا استفاده گردید. باکتری ها در محیط کشت اختصاصی کشت داده شدند و DNA ژتومیک آنها تخلیص گردید. پرایمرهای اختصاصی جهت تکثیر ژن ompLI طراحی و حساسیت و ویزگی آ«ن در PCR بررسی شد. جهت تهیه کنترل مثبت با استفاده از تکنیک کلونینگ، محصول PCR یکی از سرووار های پاتوژن به انتخاب خالص سازی شده و در وکتور pJET1.2/blunt الحاق گردید و در باکتری( E.coli (Top10 کلون گردید. تخلیص DNA نوترکیب توسط کیت انجام گرفت. پلاسمید حاوی ژن مورد نظر تعیین ترادف شد. یافته ها: با اتکا به داده های PCR مشخص شد که این ژن فقط در سرووارهای گونه پاتوژن حضور دارد و قطعه 963bp حاصل که نشان دهنده تکثیر ژن ompLI می باشد در گونه غیربیماری زای بایفلکسا مشاهده نگردید. نتیجه گیری: نتایج حاصل از تعیین ترادف محصول PCR کلون شده، حضور ژن مورد نظر را تایید کرد. واکنش PCR برای DNA نمونه به همراه کنترل مثبت در دو تیوب جداگانه انجام شد. محصول PCR مربوط به نمونه و کنترل مثبت با ژل الکتروفورز و سایز مارکر مقایسه و مورد تایید قرار گرفت.